Validação da técnica PCR em tempo real para detecção da bactéria causadora da clorose variegada dos citros em inseto vetor

Abstract

A Clorose Variegada dos Citros é uma doença que afeta variedades comerciais de laranja doce, tendo como agente causal a bactéria Xylella fastidiosa subsp. pauca, a sua ocorrência limita-se ao xilema de plantas, podendo levar a oclusão vascular, obstruindo o transporte de água e nutrientes. A doença é vinculada por espécies de cigarrinhas, da subfamília Cicadellinae (Hemiptera: Cicadellidae). O desenvolvimento de técnicas de detecção que permitam uma diagnose rápida e segura da X. fastidiosa nos insetos vetores, são de extrema importância. Sendo assim a PCR em Tempo Real (qPCR), se destaca pela rapidez em fornecer dados confiáveis, por se tratar de um método altamente sensível na detecção de DNA e RNA. O objetivo do trabalho foi validar a técnica de detecção da bactéria causadora da clorose variegada dos citros em insetos vetores por PCR em tempo real. Foram criados três grupos de análises, o grupo controle 1, grupo controle 2 (ambos com total de seis amostras) e grupo 3 (com total de doze amostras). Grupos esses, que em suas análises continha cinco, dez e vinte cabeças de cigarrinhas por amostra. No grupo controle 1, foi acrescentado 5 μL de suspensão DNA bacteriano no início da extração. No Grupo Controle 2 acrescentou-se 1 μL da suspensão do DNA bacteriano no fim da extração. O grupo 3 refere-se as amostras testemunhas. O Isolamento do DNA genômico ocorreu de acordo com o protocolo de Deng et al., (2006), com algumas modificações. A reação da qPCR foi feita utilizando os primers CVC-1 e o CCSM-1. Todas as amostras dos grupos controles atingiram o limiar da fase exponencial do Cycle Threshold (CT), com o CT de amplificação a partir 23.45° dos 40° ciclos empregados. Do grupo 3, seis amostras amplificaram com CT a partir do 34.98. Em todos os tratamentos ocorreram amplificações, o que inviabiliza a hipótese da possivel liberação de compostos do inseto durante a extração que inibam a reação da qPCR. Nos diferentes testes, as amostras com cinco cabeças de cigarrinhas, mostraram-se mais eficiente, pois tiveram os mais baixos ciclos de amplificação, isso confirma a presença do material genético da X. fastidiosa, tanto no grupo controle, quanto no grupo em estudo. _________________________________________________________________________________________ The Citrus Variegated Chlorosis is a disease that affects commercial varieties of sweet orange, having a causal agent Xylella fastidiosa subsp. Pauca, its occurrence is limited to the plant xylem and may lead to vascular occlusion, blocking the transport of water and nutrients. The disease is linked by species of leafhoppers, the Cicadellinae subfamily (Hemiptera: Cicadellidae). The development of detection techniques that allow a quick and safe diagnosis of X. fastidiosa in insect vectors, are of utmost importance. Therefore the Real-Time PCR (qPCR), stands out for its speed to provide reliable data, because it is a highly sensitive method for the detection of DNA and RNA. The objective was to validate the bacteria detection technique that causes citrus variegated chlorosis in insect vectors by real-time PCR. Three groups of tests were set, the control group 1, control group 2 (both total of six samples) and group 3 (with a total of twelve samples). These groups, which in their analysis contained five, ten twenty heads of leafhoppers per sample. In the control group 1, was added 5 uL of bacterial DNA suspension at the start of extraction. In the control group 2 was added to 1 uL suspension of bacterial DNA at the end of extraction. Group 3 refers to the control samples. The isolation of genomic DNA occurred according to the protocol of Deng et al. (2006), with some modifications. The reaction of qPCR was performed using the CVC-1 primers and CCSM-1. All samples of the control group reached the exponential phase of the threshold cycle threshold (CT) with the CT amplification from 23:45 ° to 40 ° of cycles employed. Group 3, breasts amplified samples with cT from 34.98. In all treatments occurred amplifications, which prevents the hypothesis of the possible release of insect compounds during extraction which inhibit the reaction of qPCR. In different tests, samples with five heads of sharpshooters, were more efficient because it had the lowest amplification cycles, it confirms the presence of the genetic material of X. fastidiosa, both in the control group, as in the study group.