Estudos in silico para a avaliação do padrão de reconhecimento molecular de inibidores da enzima esterol C24-metiltransferase de candida albicans (CaC24SMT)

Abstract

RESUMO

Leveduras do gênero Candida são as principais causas de infecções fúngicas invasivas e um dos grandes problemas de saúde pública, devido ao aumento de morbidade e mortalidade. Mais de 1,5 milhão de pessoas vão a óbito devido às infecções causadas por espécies do gênero Candida, especialmente Candida albicans que responde por 90% dos casos. Apesar da importância, a maioria dos fármacos disponíveis apresenta alto índice de efeitos colaterais e iminência de eventos de resistência. Algumas limitações no planejamento de novos fármacos antifúngicos decorrem da semelhança entre proteínas fúngicas e de mamíferos. Este cenário sugere a necessidade de buscar enzimas únicas em fungos para garantir maior seletividade e segurança no tratamento. Nesta perspectiva, a enzima esterol C24-metiltransferase (C24-SMT) é um alvo promissor pois participa uma etapa exclusiva para biossíntese de ergosterol em fungos, diferentemente dos mamíferos que sintetizam colesterol. Apesar disso, a ausência de dados estruturais sobre a enzima e as escassas informações sobre o modo de ligação dos inibidores conhecidos limitam a identificação e desenvolvimento de novos fármacos ativos frente a C24-SMT. A redução dessas limitações requer a compreensão do padrão das interações intermoleculares dos inibidores conhecidos de CaC24-SMT através de abordagens in silico. Assim, os objetivos deste trabalho foram determinar a estrutura 3D da CaC24-SMT através de modelagem por homologia, identificar o sítio de ligação dos inibidores e investigar o padrão de interação de inibidores conhecidos. A sequência da CaC24-SMT obtida no banco de dados Uniprot (O74198) foi alinhada a proteínas molde (3BUS e 2O57) identificadas pelo servidor HHAling-Kbest. Em seguida, 100 modelos foram construídos com auxílio do programa Modeller e avaliados com base na qualidade estereoquímica (Ramachandran) e de enovelamento (Verify 3D). O melhor modelo segundo os critérios de avaliação foi submetido a minimização e o servidor MetaPocket foi empregado para a predição de cavidades na CaC24-SMT. Em seguida, estudos preliminares de acoplamento com inibidores potentes (Ki ~ 10-9) da CaC24-SMT, disponíveis no banco de dados BRENDA, foram realizados com o programa GOLD 5.5 na cavidade da enzima com o melhor resultado consensual (Z-score = 10,66) segundo o servidor MetaPocket. O padrão de interações intermoleculares foi investigado com o servidor PLIP e revelou que os inibidores interagem com os resíduos Leu14, His10 e Pro139 e com o cofator SAM. Os complexos inibidorenzima serão investigados por dinâmica molecular a fim de aprofundar os estudos de interação com o alvo molecular. Embora preliminares, o modelo 3D da CaC24SMT e os estudos de acoplamento são inéditos e podem contribuir significativamente para o planejamento de novos fármacos antifúngicos. __________________________________________________________________________________ ABSTRACT : Yeasts of the genus Candida are the major causes of invasive fungal infections and one of the major public health problems due to increased morbidity and mortality. More than 1.5 million people worldwide die due to infections caused by species of the genus Candida, especially Candida albicans which accounts for 90% of cases. Despite the importance, most available drugs have a high rate of side effects and imminence of resistance events. Some limitations in the new antifungal drugs design derives from the similarity between fungal and mammalian proteins. This scenario suggests the need to find unique enzymes in fungi to ensure greater selectivity and safety in the treatment. In this perspective, the sterol enzyme C24-methyltransferase (C24-SMT) is a promising target because it participates in an exclusive stage for biosynthesis of ergosterol in fungi, unlike the mammals that synthesize cholesterol. Despite this, the lack of structural data of the enzyme and the information about the mode of binding of known inhibitors limit the identification and development of new drugs active against C24-SMT. Reduction of these limitations requires an understanding of the intermolecular interactions mode of known inhibitors of CaC24SMT through in silico approaches. So, the objectives of this work were to determine the 3D structure of CaC24-SMT through homology modeling, to identify the site of inhibitor binding and to investigate the pattern of interaction of known inhibitors. The CaC24-SMT sequence obtained from the Uniprot database (O74198) was aligned with template proteins (3BUS and 2O57) identified by the HHAling-Kbest server. Then, 100 models were built using the Modeller program and evaluated based on stereochemical quality (Ramachandran) and folding (Verify 3D). The best model according to these evaluation criteria was minimized and the MetaPocket server was used to predict cavities in CaC24-SMT. Then, preliminary docking studies with potent CaC24-SMT inhibitors (Ki ~ 10-9), available on the BRENDA database, were performed with the GOLD 5.5 program in the best consensus cavity (Z-score = 10,66). The intermolecular interaction mode was investigated with the PLIP server and revealed that the inhibitors interact with the Leu14, His10 and Pro139 residues and with the SAM cofactor. Inhibitor-enzyme complexes will be investigated by molecular dynamics in order to deepen the interaction studies knowledge with the target. Although preliminary, the 3D model of CaC24-SMT and docking studies were unpublished and can contribute significantly to the design of new antifungal drugs.